新研究：新冠患者病毒存在快速进化风险，需更多序列追踪进化

新冠病毒的进化速度、病毒与被感染者肺中其他微生物互动的方式，目前尚不清楚。近日，国际学术期刊《临床传染病》（Clinical Infectious Diseases）刊发了来自中国研究团队的学术论文：新冠病毒在患者体内的基因多样性（Genomic diversity of SARS-CoV-2 in Coronavirus Disease 2019 patients），聚焦了以上问题。

研究团队对8例新冠肺炎患者，25例社区获得性肺炎（CAP，指在医院外罹患的肺实质炎症）患者和20例健康对照者的支气管肺泡灌洗液进行了转录组测序。研究得出在一些新冠病毒感染者体内发现了病毒多样性水平升高，这表明病毒存在快速进化的风险。尽管没有发现宿主内变异（intra-host variants）传播的证据，但也不应忽视这种风险。

研究团队还表示：病毒在感染患者后会在其体内进化，这可能会影响病毒的毒力、传染性和可传播性。尽管宿主内变异如何在人群中传播尚不清楚，但有必要加强对人群中病毒进化和相关临床变化的监测。

值得注意的是，患者新冠病毒基因组可能高度多样化，这在其他病毒中也能观察到。高多样性可能会增加病毒种群的适应性，使其难以消除。需要进行进一步的研究，以探索这可能如何影响对病毒的免疫反应，以及在人体或在传播过程中是否存在对不同毒株起作用的选择。

研究最后总结道，总的来说，这项研究揭示了患者体内新冠病毒的进化，这是大多数RNA病毒的共同特征。这些变异如何影响病毒的适应度和群体的遗传多样性，有待进一步的研究。目前，公共数据库只共享有限的序列，因此迫切需要积累更多的序列来跟踪病毒基因组的进化，并将这些变化与临床症状和结果联系起来。

该论文团队成员来自以下单位：中国科学院北京基因组研究所；中国科学院大学；国家卫健委重点实验室，中国医学科学院病原生物学研究所；北京大学生物医学前沿创新中心；北京大学人民医院呼吸与危重症医学科；广东省新发传染病诊治重点实验室，新发传染国家重点实验室；福建人民医院；西安交通大学第一附属医院；中国科学院动物进化与遗传前沿交叉卓越创新中心等。论文的通讯作者为中国科学院北京基因组研究所研究员、博士生导师李明锟。

新冠病毒感染者体内高水平的宿主内变异

根据目前的数据，估计早期的新冠病毒基本传染数（R0）在2.2到3.5之间，对公共健康构成了严重威胁。最近的研究已将蝙蝠确定为新冠病毒的可能来源，该病毒可能使用与SARS-CoV相同的细胞表面受体，即ACE2。这些研究提高了我们对新冠病毒的理解。但是，我们对新型病毒的了解仍然有限。

在人体中，新冠病毒得承受强大的免疫压力，这可能令病毒不断积累突变，从而突破免疫系统的控制。这些突变可能导致新冠病毒的毒力、传染性和传播性发生变化。因此，研究者们认为必须研究突变的模式和发生的频率。

研究团队对8名患有新冠病毒感染者的支气管肺泡灌洗液（BALF）样本进行了转录组测序。2019年12月24日至2020年2月9日之间收集的这110个序列研究发现，宿主内变异的数量在0到51之间，中位数为4，表明该病毒的进化速率很高。

研究团队总共鉴定出84个宿主内变异，其最小等位基因频率（MAF，通常是指在给定人群中的不常见的等位基因发生频率）大于5％，而25个变异的MAF大于20％。

值得注意的是，变异的数量与测序深度无关。

总体Ka/Ks（异义替换（Ka）和同义替换（Ks）之间的比例，可以判断是否有选择压力作用于这个蛋白质编码基因）明显小于1，这对于宿主内变异和群体数据中观察到的多态性而言是相似的，这表明：纯化选择作用于两种类型的突变。

在基因中观察到的变体数目与基因长度成比例（对于宿主内变异，cor＝0.950，p＝8E-06；对于多态性，cor＝0.957，p＝4E-06）。尽管在多位患者中仅观察到一小部分变异（图2C，84位患者中的2位），但某些位置更容易发生突变，例如位置10779，在所有7位患者中均观察到了突变等位基因A，频率范围从15％到100％。

每个个体的宿主内变异数量显示出较大的差异（MAF≥5％的变异为0到51，中位数为4； MAF≥20％的变异为0到19，中位数为1），这不能用批次效应、覆盖范围差异或污染（新冠病毒感染者一至四即nCoV1-4在一批中，新冠病毒感染者五至八即nCoV5-8在另一批中；大多数突变未在群体数据中观察到）来解释。研究团队还注意到，变异的数量与症状发作后的天数或患者的年龄无关。

总体而言，没有找到导致新冠病毒感染者六中有极高水平变体的任何原因（51个变体）。

研究团队表示，需要更大的人群规模来研究此类异常值的频率以及它们与宿主免疫反应水平或病毒复制率是否相关。研究人员还注意到其他病毒的异常值。值得注意的是，变异的来源可能是感染后体内发生的突变，也可能是多重传播的新冠病毒株。

研究团队在讨论环节提到，RNA病毒具有很高的突变率。因此，RNA病毒容易产生对药物的抗性并逃避免疫监视。新冠病毒的突变率仍不清楚。但是，这项研究得出新冠病毒的突变率应与SARS-CoV处于相同的数量级。高突变率还导致RNA病毒中高水平的宿主内变异。对于频率≥5％的变异体，新冠肺炎患者的宿主内变异体的中位数为4，该发生率与埃博拉病毒病研究中报道的发生率无明显差异（134个样本中频率≥5％的655个变异体，p> 0.05），这表明新冠病毒的突变率也与埃博拉病毒相当。

另外，此前的研究提出一种核糖核酸外切酶（ExoN）可以在SARS-CoV中提供校正活性，并且注意到该基因中的所有三个关键基序在SARS-CoV和新冠病毒之间是相同的。此外，在这些基序中均未检测到多态性或宿主内变异，表明该基因是高度保守的，因此它可能是抗病毒治疗的潜在靶标。

研究团队指出，尽管在多态性或宿主内变异中均未发现任何突变热点基因（突变几率较高的碱基序列），但观察到不同个体之间共有宿主内变异，这暗示着病毒在患者体内适应性进化的可能性，这可能会影响其抗原性、毒力和病毒的传染性。

值得注意的是，患者新冠病毒基因组可能高度多样化，这在其他病毒中也能观察到。高多样性可能会增加病毒种群的适应性，使其难以消除。需要进行进一步的研究，以探索这可能如何影响对病毒的免疫反应，以及在人体或在传播过程中是否存在对不同毒株起作用的选择。

没有证据表明样品之间宿主内部变异的传播

在八名新冠病毒感染者中，感染者四（nCoV4）和感染者七（nCoV7）来自同一家庭，症状发作的日期相差五天。高度怀疑病毒由感染者四传染给感染者七，特别是考虑到只有感染者四曾进入武汉华南海产品市场，这是疫情暴发的起点，并被怀疑是新冠病毒的起源。

首先，对于两个样品，病毒的共有序列相同，所有四个通过感染者四选择标准的宿主内变异在感染者七中都没有检测到。研究者进一步将研究范围扩大到MAF≥2％的所有变异，并得到至少3个读段的支持。通过这样做，研究者检测到两个样本之间共有7个变异（共25个）。

但是，感染者四和感染者七中的MAF与其他样品中的MAF相似，这表明这些位置要么容易出错，要么容易突变。因此它们不能支持这些变异的传播。

同时，在所有84个宿主内部变异中，只有3个在种群数据中是多态的（位置7866 G / T；27493 C / T；28253 C / T）。这种少量的重叠也表明宿主内变异很少传播给其他样品。但是，不能排除当前数据库低估了种群中序列多样性的可能性。

研究团队在讨论中还提到，在本研究的单个传播事件中，研究团队没有发现多种毒株传播的证据。然而，尚不清楚这些宿主内变异是发生在传播之前还是传播之后，这也会产生不同的结论。此外，传播可能会遇到瓶颈，这也可能导致多样性的丧失。

没有发现新冠患者中有任何特定的微生物群模式

除病原体外，肺部的其他微生物群，也与疾病的易感性和严重性有关。肺微生物群的改变可能会改变针对病毒和继发性细菌感染的免疫反应。因此，了解包括可能引起继发感染或对黏膜免疫系统产生影响的细菌的微生物群，可能有助于预测并减少并发症。

黏膜免疫系统，指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道粘膜下及一些外分泌腺体处的淋巴组织，是执行局部特异性免疫功能的主要场所。

总体来说，新冠病毒感染者、社区获得性肺炎患者和健康组之间的微生物群组成存在显着差异（R2=0.07，p=0.001）。

但是，某些新冠病毒感染者的样本聚类分析表明：某些样品的微生物群比较贫乏。除去有问题的样本后，研究仍然发现新冠病毒感染者和社区获得性肺炎患者均与健康对照组不同（新冠病毒感染者与健康组：R2=0.45，p =0.001；社区获得性肺炎患者与健康组：R2=0.10，p=0.002），这表明他们的肺部菌群发生了微生态失调。微生物群可分为三种不同类型。特别是，群集I中的微生物群主要由可能的病原体所致，而其他群集中的微生物则更为多样。

通过进一步调查每个群集的种类，研究团队发现，III型细菌主要是在口腔和呼吸道中经常观察到的共生菌，而II型细菌则主要是环境微生物，因此高度怀疑这其实是受到了污染。因此，微生物群要么富含病原体（I型），要么富含共生菌（III型），或者由于低微生物载量低而无法确定（II型）。

在所测的八个感染者中，六个新冠病毒感染者样品中的微生物群是富含病原体的，而其他两个样品则富含共生菌。此外，两个宿主内新冠病毒变异数量过多的新冠病毒感染者样品（感染者二、感染者六）均为富集病原体的。

论文提到，病毒的压倒性优势可能与更高的复制率有关，并且还可能潜在地刺激针对该病毒的强烈免疫反应，在这种情况下，预期会发生过多的宿主内突变。但是，由于该分析仅包括8名新冠病毒感染者，并且绝对微生物载量尚不清楚，因此需要更多数据进行进一步研究。

研究者们讨论指出，除了肺炎组的微生物多样性明显低于健康对照组的特点外，他们没有发现新冠肺炎患者中有任何特定的微生物群模式，CAP患者中也没有。一个可能的原因可能是肺炎患者使用了抗生素。然而，这并不适用于所有肺炎样本，因为在一些样本中发现了相当比例的细菌，包括2例新冠肺炎患者。

目前已知的是，病毒感染，尤其是呼吸道病毒的常见并发症，继发性细菌感染往往导致发病率显著增加。因此，部分新冠肺炎患者BALF中细菌水平升高可能增加继发性感染的风险。在临床资料中，新冠肺炎患者的继发性感染率在1%-10%之间。然而，细菌相对丰度/效价与感染之间的定量关系尚不清楚。

论文原文链接：https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa203/5780800?searchresult=1#